王蓉1,2 陈圆圆1,2 潘向和1,2 李鑫3 于鸿浩1,2 岳鹏鹏1,2
1. beat365唯一官网智能医学与生物技术学院 2. beat365唯一官网广西高校生物化学与分子生物学重点实验室 3. beat365唯一官网第二附属医院放射科
摘要：目的：单纯型大疱性表皮松解症(EBS)是一种单基因遗传性皮肤疾病，KRT5基因突变是其主要的遗传学病因。本研究在综合分析人KRT5基因的致病突变位点后，在其附近设计、合成3条sgRNA序列，并构建靶向小鼠KRT5基因的CRISPR/Cas9系统，以模拟人KRT5基因的致病突变。方法：分析数据库中人KRT5基因的致病突变位点，设计3条小鼠拟突变位点sgRNA序列；构建pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒，然后采用LipofectamineTM3000转染试剂将pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒共同转染入小鼠N2a细胞，再以嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行筛选；采用PCR产物测序和TA克隆测序鉴定突变序列，分析打靶效力。结果：成功构建了3个pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒，将其转入小鼠N2a细胞后，打靶KRT5基因的效力最高为64.29%,最低为16.67%。结论：设计的CRISPR/Cas9系统可以有效打靶小鼠KRT5基因，为后续建立KRT5基因编辑的小鼠模型，探讨KRT5基因在EBS发生、发展中的作用和机制奠定基础。
关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑;单纯型大疱性表皮松解症;KRT5;
DOI：10.19296/j.cnki.1008-2409.2022-05-001
PDF下载：点击下载
